J Exp Med：烟酰胺单核苷酸转移酶（NNT）通过依靠Fe-S蛋白功能而调节NSCLC线粒体代谢

人类所白血病表现出爆冷大而比较简单的细胞质化学液体，不太可能是由大肠组织的高碳连续性引发的。由于活连续性碳(ROS)的生成是这种化学液体的副游离，因此必才可以烟酰胺核苷盐酸二核苷盐酸磷盐酸(NADPH)的形式来减小水解应激，以解决问题这种细胞质活连续性的减慢。烟酰胺单核苷盐酸转移酵素(NNT)可通过NADPH的生成来确保细胞质的抗水解技能，但其在非小细胞不必白血病(NSCLC)里的作用早已明确。本深入研究发掘出NNT的爆冷调在白血病果蝇框架里相比减慢了癌症的转变成和侵扰连续性。另外，再进一步深入研究发掘出NNT紊乱不必引致细胞质特连续性障碍，这与水解应激的大量增大全面性联，而是以线粒体亚基的活连续性减小为标志。这些瑕疵与NADPH的确实和ROS的依靠有关，这断定NNT在加重这些更为关键连续性亚基镁的水解里起着更为关键连续性作用。

实验设计

许多少用的白血病果蝇框架是运用C57BL6/J果蝇的饲养战略而建立。无聊的是，这些果蝇携带纯合位点7-11的框内紊乱以及细胞质里Nnt基因序列的错义基因型引致非特连续性亚基的爆冷调。因此，可以运用这种自然紊乱的基因型(NntΔex7-11)来称赞NNT对白血病引发的冲击。

首先，都用Kras基因型(LSL-KrasG12D/+)引发的白血病框架来检测Nnt爆冷调对白血病引发的冲击。携带Cre改组酵素的腺病毒LSL-KrasG12D/+果蝇，可抑制KrasG12D在大肠上皮里的爆冷调和大肠脑瘤的转变成。运用LSL-KrasG12D/+果蝇和C57BL6/J果蝇产卵显现出Nnt+/+爆冷调果蝇或NntΔex7-11/Δex7-11爆冷调果蝇(三幅1A-1B)。该框架里Nnt的爆冷调引致Cre改组酵素诱发癌症的负荷加快3个月(三幅1C-1D)。然后，运用Kras基因型与p53紊乱同时爆冷调(LSL-KrasG12D/+；Trp53flox/flox，也称为KP)建立白血病框架。Nnt的爆冷调没有人扭转Cre抑制的KP果蝇的存活率(三幅1E)。无聊的是，在这个框架里，p53的紊乱消除了Nnt爆冷调对白血病转变成的冲击，并且无论Nnt爆冷调如何，实验再一都共存相比的癌症负荷(三幅1F)。白血病负荷百分比的加权在不尽相同表型果蝇错综比较简单没有人关联连续性(三幅1G-1H)。

虽然不尽相同表型果蝇错综比较简单的癌症负荷没有人关联连续性，但确实推论到框架里癌症侵扰连续性的关联连续性。我们发掘出Nnt+/+果蝇里51.3%的癌症为3级(脑瘤)或以上，而NntΔex7-11 / +和NntΔex7-11 /Δex7-11果蝇里差不多36.5%和38.8%的癌症是管理人员(三幅1I)。Nnt+/+果蝇引发4级癌症的频率值得注意增大，证明了癌症侵扰连续性的巨大变化(三幅1J)。总之，这些数据库断定Nnt作出贡献了白血病的引发和侵扰。

2 NNT的紊乱不冲击细胞质里硫碳还亚基(TXN)的抗水解体系

为了再进一步指标NNT对白血病生物学的冲击，首先指标shRNA妨碍NNT亚基的爆冷调，除此以外4个爆冷调NNT亚基的NSCLC细胞不必系 (A549, H1299，H2009和PC9)和不爆冷调NNT亚基的H441细胞不必(三幅2A)。妨碍NNT亚基爆冷调抑制NSCLC细胞不必的裂解技能(三幅2B)。并且发掘出慢病毒4过后NNT的缩水减小了H2009和PC9细胞不必的生存技能(三幅2C)。此外，H441细胞不必的裂解不受NNT的冲击。

举例来说显然NNT有助于NADPH的还原成技能，从而确保细胞质亚基抗水解管理系统处于还原成静止状态(三幅2D)。妨碍NNT减小了H1299、H2009和PC9细胞不必里NADPH: NADP+的百分比 (三幅2E)。慢病毒4过后细胞质里H2O2值得注意增大(三幅2F)，所以NNT对H2O2止血现实生活很关键连续性。

为了未确定这些细胞质ROS的增大否与细胞质抗水解管理系统有关，于是运用Western blotting指标细胞质里过水解物亚基3(PRDX3)的水解静止状态。H2O2通过PRDX3止血，即一对半乳糖多肽抑制PRDX3转变成复合物，并且不能通过TXN还原成这些半乳糖多肽才能还原成PRDX3的抗水解特连续性。PRDX3复合物的依靠是PRDX3水解的标志，是细胞质水解应激的都用标志物。

奥柳斯芬是一种TXN还原成酵素(TRXR)相似物，虽然奥柳斯芬的外科手术不必引致PRDX3亚基大量水解，但NNT的紊乱并没有人增大PRDX3的水解(三幅2G)。此外，NNT的紊乱也没有人减小细胞质TXN2或TRXR2的亚基水准。总之，这些结果断定NNT在NSCLC细胞不必裂解技能上发挥关键连续性作用，但NNT活连续性的归因于未必不必破坏细胞质TXN抗水解管理系统，也不不必引发相比的水解应激。

3 NNT的紊乱不必破坏细胞质的水解技能

鉴于NNT在IMM里的定位及其冲击上皮细胞上氢原子梯度和还原成技能，于是试三幅探讨NNT对细胞质水解化学液体否关键连续性。首先，都用艾利细胞不必外梯度加权仪来进行细胞质压力飞行测试，指标NNT紊乱对一般细胞质水解特连续性的冲击。结果发掘出NNT紊乱细胞不必的耗碳量(OCR) 随细胞质相似物的依次传递而被缩减(三幅3A)。值得一提的是的是，NNT紊乱细胞不必的最大颤动技能在不也就是说非谐振颤动的完全值得注意减小(三幅3B)。这提示细胞质水解瑕疵与NNT对氢原子梯度的冲击全面性联。鉴于NNT紊乱相比冲击颤动技能，于是检测NNT紊乱的H441细胞不必否比NNT爆冷调细胞不必不具备多得多的水解和更爆冷的糖酵解技能。这说明这些细胞不必在没有人NNT的完全不太可能通过细胞质NADPH来源而确保细胞质的特连续性。

细胞质的水解化学液体也就是说ETC的特连续性，ETC由介导电子传递的Fe-S亚基一水解氮都由。考虑到Fe-S亚基一水解氮的衍生物酶现实生活必才可NADPH，于是深入研究NNT妨碍后细胞质颤动特连续性的降低否与Fe-S亚基全面性。细胞质压力飞行测试可以对颤动特连续性来进行普遍连续性的加权，但不可以对单个ETC一水解氮掺入来进行指标。因此，笔记来进行了更为专业的实验来加权Fe-S亚基依赖的颤动全面性一水解氮(I, II, III)。结果发掘出，基于一水解氮I(丙甲基盐酸和延胡索盐酸)的摄取，在NNT妨碍后一水解氮I-III的活连续性值得注意减小(三幅3C)。此外，NNT瑕疵细胞不必相比减小了糖类的OCR，断定减小了糖类脱氢酵素(SDH)活连续性和一水解氮II-III流量(三幅3D)。引致这一现象的关键连续性主因是SDH在ETC和TCA循环管理系统里扮演着双重主人公。

除了通过ETC确保电子流量外，Fe-S亚基还确保对水解化学液体至关关键连续性的其他亚基酵素的特连续性。为了未确定NNT否参与其他Fe-S亚基的特连续性，笔记指标了TCA循环管理系统里Fe-S亚基——顺乌头盐酸酵素(ACO2)的活连续性。结果发掘出妨碍NNT值得注意减小了NSCLC细胞不必系里ACO2的活连续性(三幅3E)。ACO2活连续性的减小不太可能不必破坏TCA循环管理系统，进而缩减驱动ETC流量的还原成连续性液体的生成。为了补充非小细胞不必白血病里ACO2特连续性的加权，于是称赞Nnt爆冷调对KP白血病里ACO2活连续性的冲击。结果断定，Nnt+/+果蝇癌症里Aco2活连续性相比高于NntΔex7-11/+ 和NntΔex7-11/Δex7-11里的，缺乏Nnt的癌症表现出最低的活连续性(三幅3F)。

4 其会连续性NADPH在NNT紊乱后确保Fe-S亚基特连续性

为了未确定与妨碍NNT全面性的细胞质Fe-S亚基特连续性的减小否与NADPH:NADP+的减小有关，我们试三幅提供一种细胞质NADPH的其会连续性来源。为了实现这一目标，我们考虑了蜂蜜细胞质里NADH激酵素pos5p，它可以转录NADH而显现出NADPH。虽然pos5p实际上在细菌里也有其会爆冷调，但据我们出名，pos5p还没有人被引入爬行动物管理系统。为了检测我们否很难有效地在人类所NSCLC细胞不必的细胞质里爆冷调pos5p亚基，我们对蜂蜜亚基来进行了标记，使其包含HA-tag。Western blot结果显示，在H1299、H2009和PC9细胞不必的细胞质里失败爆冷调了HA-tag标记的pos5p亚基(三幅4A)。考虑这些细胞不必系是为了指标pos5p修复和NNT紊乱全面性的Fe-S亚基瑕疵的技能，发掘出妨碍NNT后对它们引发很严重的冲击。

pos5p的爆冷调起死回生了细胞不必里妨碍NNT后引发的NADPH: NADP+百分比的缩减(三幅4B)。这与爆冷调pos5p细胞不必里pos5p被妨碍后颤动支链比较简单文艺活动的缩减有关(三幅4C和4D)。此外，pos5p的爆冷调完全起死回生了NNT妨碍后ACO2活连续性的降低(三幅4E)。总之，这些数据库断定确保NNT爆冷调紊乱时NADPH的水准可以保护NSCLC细胞不必里Fe-S亚基的特连续性。

5 NNT的紊乱不不必破坏Fe-S亚基的衍生物酶

考虑到细胞质其会连续性NADPH很难减慢NNT紊乱全面性Fe-S亚基的瑕疵，并且NADPH是高效确保Fe-S亚基衍生物酶的必备条件，因此我们接下来试三幅未确定NNT活连续性否确保这一现实生活。Fe-S亚基衍生物酶引发在一个由半乳糖脱硫酵素(NFS1)和Fe-S支架亚基(ISCU)都由的多亚基一水解氮里。一水解氮里任何一种掺入的紊乱都不必冲击衍生物酶，并且也与细胞质瑕疵全面性。因此，我们妨碍NFS1或ISCU爆冷调来深入研究破坏Fe-S亚基衍生物酶后对颤动支链和ACO2的冲击。

在H2009细胞不必里，妨碍NFS1后值得注意减小丙甲基盐酸/延胡索盐酸反应和糖类反应里颤动支链一水解氮I-III的活连续性，而在PC9细胞不必里只有一水解氮II-III活连续性被相比减小(三幅5A和5B)。另外，两个细胞不必系里，在丙甲基盐酸/延胡索盐酸和糖类的作用下，妨碍ISCU爆冷调后值得注意减慢了OCR(三幅5A和5B)。并且妨碍NFS1或ISCU后值得注意减小了细胞不必系里ACO2活连续性(三幅5C)。无聊的是，NNT妨碍后所引发的瑕疵与Fe-S亚基衍生物酶所才可液体引发的瑕疵是同等关键连续性的(三幅5A-5C)。

为了证明Fe-S亚基瑕疵对NSCLC细胞不必的细胞质化学液体有特连续性连续性冲击，我们对妨碍NNT或ISCU细胞不必来进行基于液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)的化学液体组学深入研究。 对这些细胞不必TCA循环管理系统的化学液体物来进行加权，结果显示大多数里间游离的核素引发了值得注意巨大变化(三幅5D)。这些都断定了水解化学液体的严重破坏和Fe-S亚基特连续性瑕疵的一致连续性。具体地说就是妨碍NNT和ISCU爆冷调后，丙甲基盐酸、延胡索盐酸和富马盐酸被消耗掉。NNT紊乱细胞不必里的糖类水准被耗尽，但妨碍ISCU细胞不必里并没有人此结果。另外，妨碍ISCU细胞不必里糖类大量依靠，而在NNT紊乱细胞不必里则不共存此现象(三幅5D)。

除了Fe-S亚基ACO2和SDH外，TCA循环管理系统还也就是说另一种细胞质Fe-S亚基——硫辛盐酸衍生物酵素(LIAS)的特连续性。LIAS对于硫辛盐酸的衍生物以及关键连续性硫辛盐酸食盐基团的共轭都并不更为关键连续性，硫辛盐酸食盐基团由PDH (E2)和α-甲基戊二盐酸脱氢酵素(二氢硫辛酰胺S-琥珀酰转移酵素，DLST)都由。LIAS对Fe-S亚基衍生物酶的破坏特别恰当，因为其Fe-S簇在催化现实生活里被消耗掉掉，这就要求迅速地来进行亚基交换。事实上，妨碍NFS1和ISCU爆冷调不必大量缩减PC9细胞不必里PDH-E2和DLST的脂化，然而妨碍NNT对亚基脂化无冲击(三幅5E)。总的来说，这些数据库断定，NNT引发酵素和化学液体瑕疵，它们的瑕疵与Fe-S亚基衍生物酶的破坏全面性，但NNT不不太可能直接冲击这一现实生活。这反映出妨碍NNT和ISCU后对TCA循环管理系统显现出相似但又不尽相同的冲击。

6 NNT的紊乱破坏氨基盐酸化学液体

除了消耗掉TCA循环管理系统里间体外，NNT瑕疵细胞不必的LC-HRMS化学液体组学加权断定氨基盐酸化学液体肥胖。妨碍NNT作出贡献长支链油脂烷基嘌呤的大量依靠，而长支链油脂烷基嘌呤是氨基盐酸β-水解的底物(三幅6A)。鉴于在NNT瑕疵细胞不必里共存颤动管理系统瑕疵，我们推论这些烷基嘌呤的增大是由于氨基盐酸水解缩减。我们发掘出在H1299和PC9细胞不必里OCR与菠萝盐酸食盐的水解有关，妨碍NNT后OCR减小(三幅6B)。我们还推论到NNT瑕疵细胞不必里油脂和不油脂均大量依靠(三幅6C)。氨基盐酸衍生物必才可消耗掉大量NADPH，而且NNT妨碍后NADPH的确实减小，于是我们显然这些氨基盐酸水准的增大是由于其会连续性氨基盐酸摄入的增大。另外，我们发掘出，NNT瑕疵细胞不必减慢了对电子显微镜菠萝盐酸相似物的吸收技能(三幅6D)。为了称赞NNT妨碍后氨基盐酸的依靠否是一个潜在的不利因素，我们都用油脂菠萝盐酸酯刺激NNT瑕疵细胞不必24小时，发掘出NNT妨碍后使H1299和H2009细胞不必对菠萝盐酸食盐恰当(三幅6E)。此外，NNT妨碍后值得注意提高了H1299和PC9细胞不必对单一不油脂油盐酸食盐的恰当连续性(三幅6F)。鉴于其会连续性氨基盐酸补充的有害冲击，我们预计细胞不必外肝细胞消耗掉将保护NNT的紊乱。令人高兴的是，培养基里的肝细胞消耗掉更为严重了NNT的缩水(三幅6G)。更关键连续性的是，NNT妨碍后细胞不必外肝细胞缺少不必增大NADPH的消耗掉(三幅6H)，这断定在缺乏其会连续性氨基盐酸的完全被迫衍生物氨基盐酸，使NNT瑕疵细胞不必里NADPH的确实减小。总的来说，这些数据库断定NNT不太可能在调节氨基盐酸化学液体里起关键连续性作用，NSCLC细胞不必的氨基盐酸化学液体紊乱不太可能是一个可运用的弱点。

7 NNT紊乱后细胞质小分子会过水解氢酵素(MitoCatalase)起死回生Fe-S亚基特连续性

Fe-S亚基对分子会碳和更多有害液体的水解并不恰当。虽然我们没有人推论到细胞质亚基抗水解管理系统的水解静止状态变为，但这未必排除NNT妨碍后引发的细胞质ROS更多将这些恰当连续性镁水解。为了探究这种更再进一步，我们都用了细胞质小分子会的过水解氢酵素(MitoCatalase)来减慢细胞质的抗水解技能。我们失败地在H1299、H2009和PC9细胞不必里过爆冷调了MitoCatalase (三幅7A)。MitoCatalase的爆冷调也以外减慢了NNT妨碍后全面性细胞质里H2O2的显现出(三幅7B)。这与NNT妨碍后颤动支链比较简单文艺活动的缩减一般来说应(三幅7C和7D)。另外，MitoCatalase的爆冷调恢复NNT妨碍后ACO2的活连续性(三幅7E)。综上所述，这些数据库断定，提高细胞质止血H2O2的技能可以不太可能会NNT妨碍后Fe-S亚基引发瑕疵，从而使NNT在不太可能会Fe-S亚基引发水解全面性发挥作用，但对Fe-S簇的衍生物酶无作用。

结论

总之，我们的深入研究断定，NNT对白血病生物学不具备关键连续性意义，主要是通过抑制Fe-S亚基而作出贡献细胞质化学液体。与即使如此称赞NNT特连续性的深入研究不尽相同，我们描述了NNT对NSCLC里细胞质水解还原成平衡状态的微妙冲击。在NSCLC里，NNT活连续性不太可能加重了大量水解化学液体引发的水解应激反应。我们的发掘出再进一步断定了细胞质化学液体在白血病引发里的更再进一步，说明细胞质特连续性的减慢不太可能是白血病外科手术的一个关键连续性靶点。酵素TPH-1对肝保护起更为关键连续性作用，不太可能作为外科手术CKD的潜在外科手术靶点。

许多现代引自：

Ward NP, Kang YP, Falzone A, Boyle TA, DeNicola GM. Nicotinamide nucleotide transhydrogenase regulates mitochondrial metabolism in NSCLC through maintenance of Fe-S protein function.J Exp Med (IF: 10.892). 2020 Jun 1;217(6):e20191689. doi: 10.1084/jem.20191689.